Un profilo terpenico ottimizzato per un nuovo olio di cannabis medica

Un profilo terpenico ottimizzato per un nuovo olio di cannabis medica. Di seguito trovate la video intervista su Telecolor del dott. Lorenzo Calvi, la video intervista per Tgr Toscana al prof. Fabio Firenzuoli e alla dottoressa Valentina Maggioni del CERFIT, un articolo scritto per Farmacista33 da Tommaso Pelagatti, Roberto Spampatti, Alessia Ventimiglia
Laboratorio galenico Farmacia TILI e l’articolo pubblicato sulla rivista scientifica pharmaceutics tradotto da noi in Italiano e pdf con il testo in inglese scaricabile.

Medicina e Ricerca: Cannabis Terapeutica Intervista al dr. Lorenzo Calvi

Telecolor

Cannabis terapeutica, le potenzialità del fitocomplesso

Farmacista33

L’utilizzo della Cannabis nel trattamento di numerose circostanze patologiche risale a migliaia di anni fa. Negli ultimi decenni lo studio approfondito di questo fitocomplesso ha rivelato uno straordinario potenziale del suo utilizzo nella terapia di differenti condizioni patologiche quali dolore cronico, nausea e vomito indotto da chemioterapici, spasticità, epilessia e per fino depressione e ansia, tanto da essere indicata come una valida alternativa alle terapie convenzionali.

Purtroppo, un buon numero di medici risulta essere ancora reticente nella prescrizione di cannabis, non tanto per la mancanza di formazione sull’argomento, bensì per l’assenza di un metodo standardizzato della procedura di estrazione che inevitabilmente porta a formulazioni non conformi ad un preciso standard in termini di composti attivi.
La ricerca di Maggini V et al. affronta la problematica della standardizzazione del metodo di estrazione al fine di ottenere un processo altamente riproducibile e un prodotto finito di alta qualità.
I terpeni (limonene, beta-mircene, alfa-pinene…), in parte responsabili dell’attività farmacologica della cannabis, sono molecole altamente volatili la cui concentrazione è influenzata dalle condizioni di estrazione ad alte temperature, per questo motivo la messa a punto di un metodo di estrazione funzionale permette di ottenere un prodotto con la maggiore concentrazione in terpeni.
Come ampiamente dimostrato dalla letteratura scientifica, fondamentale per la conversione dei cannabinoidi acidi nei loro corrispettivi decarbossilati, risulta necessario il riscaldamento del materiale vegetale, questo passaggio rappresenta una finestra critica per l’ottenimento di un preparato di alta qualità in quanto i tempi e le temperature utilizzate per effettuare questo processo influenzano significativamente le concentrazioni di terpeni all’interno del prodotto finito.

I metodi di estrazione finora utilizzati provocavano un elevato “stress” del fitocomplesso sottoponendo le infiorescenze ad alte temperature per tempi prolungati sia in fase di decarbossilazione sia in fase di estrazione, il nuovo metodo CERFIT, esposto nel suddetto articolo, invece, alterna intervalli di riscaldamento con intervalli di raffreddamento preservando le caratteristiche del fitocomplesso e ottenendo un profilo terpenico più stabile possibile. Nello specifico, il metodo CERFIT prevede una decarbossilazione controllata a intervalli regolari di riscaldamento e raffreddamento riducendo al minimo lo stess termico e successivamente l’estrazione viene eseguita con un sonicatore a sonda posto direttamente all’interno di un beker contenente infiorescenze in olio MCT il tutto mantenuto in un bagno d’acqua refrigerato. Confrontando i diversi metodi di estrazione da un punto di vista analitico è stato dimostrato che attraverso il nuovo metodo CERFIT il profilo terpenico dei preparati a base di cannabis è risultato migliorato rispetto ai precedenti processi. La tendenza all’aumento della concentrazione delle molecole farmacologicamente attive ha permesso di rappresentare chiaramente il cosiddetto “effetto entourage”, infatti il potere del fitocomplesso cannabico è maggiore rispetto alla somma dei singoli componenti (cannabinoidi, terpeni, flavonoidi ecc….) dimostrando di avere tra loro un effetto sinergico, una maggior efficacia d’azione e una tossicità significativamente più bassa.

Nella messa a punto della nuova metodologia di estrazione si è inaspettatamente giunti ad un altro importante traguardo che getta le basi per preparati a base di cannabis sempre più stabili e di qualità, in particolare la composizione degli estratti ottenuti con il metodo CERFIT erano privi i terpeni ossidati, prodotti di degradazione terpenica identificati come marker di invecchiamento.
Il futuro del metodo CERFIT si auspica possa essere il suo utilizzo nella sperimentazione clinica, solo così sarà possibile verificare se alla comprovata ottimizzazione della metodologia di estrazione corrisponda una maggior efficacia del farmaco galenico ottenendo prodotti sempre più standardizzati.
Ad oggi molte aziende si propongono di fornire alle farmacie estratti oleosi di cannabis da sfruttare come materie prime nell’allestimento di preparati, ma nessuna di queste fornisce analisi esaustive e standardizzate riguardo le molecole che compongono questo straordinario fitocomplesso. Le infiorescenze di cui si approvvigiona un laboratorio galenico che allestisce estratti oleosi di cannabis sono molto più della scheda tecnica che le accompagna, sono molto più di un titolo di THC e CBD perchè, come dimostra il metodo CERFIT, vale la pena analizzare tutte le molecole che le compongono con l’obiettivo di fornire finalmente a medici e pazienti un intero fitocomplesso Standardizzato.

Maggini V, Calvi L, Pelagatti T, Gallo ER, Civati C, Privitera C, Squillante F, Maniglia P, Di Candia D, Spampatti R, Firenzuoli F. An Optimized Terpene Profile for a New Medical Cannabis Oil. Pharmaceutics. 2022 Jan 27;14(2):298.

Tommaso Pelagatti, Roberto Spampatti, Alessia Ventimiglia.
Laboratorio galenico, Farmacia TILI
Erba

Farmacista33 .

Questo articolo fa parte del numero speciale di Pharmaceutics: Nuove prospettive per la somministrazione di cannabis per uso medico: dalle formulazioni tradizionali a quelle avanzate. E poi?

Articolo e tabelle tradotte dal sito della rivista scientifica Pharmceutics https://www.mdpi.com/1999-4923/14/2/298https://www.mdpi.com/1999-4923/14/2/298

Metodo Cerfit autori: Maggini Valentina, Lorenzo Calvi, Tommaso Pelagatti, Eugenia R. Gallo, Celine Civati, Carlo Privitera, Flavio Squillante, Paolo Maniglia, Domenico Di Candia, Roberto Spampatti, and Fabio Firenzuoli. 2022.

Astratto

Lo scopo di questo studio analitico era quello di sviluppare una formulazione avanzata di olio di Cannabis medicinale (MCO) confrontando il profilo chimico di diversi estratti ottenuti con due metodi esistenti (SIFAP e CALVI) e un metodo originale aggiornato (CERFIT). I metodi di preparazione sono stati applicati variando il solvente, la temperatura e la durata delle fasi di decarbossilazione ed estrazione. Sono state eseguite analisi HPLC-MS/MS TSQ e GC/FID-HS per studiare i contenuti di cannabinoidi e terpeni nei tre estratti di olio. Il profilo dei cannabinoidi è rimasto comparabile tra le formulazioni. Gli estratti di CERFIT hanno mostrato una quantità superiore di forme idrocarburiche terpeniche totali (ad es. limonene e α-pinene) senza che si verificasse alcuna degradazione (ad es. terpeni ossidati non quantificabili). Così,Parole chiave: Cannabis sativa L. ; uso medico ; preparazione dell’olio ; metodo di estrazione ; cannabinoidi ; monoterpeni ; sesquiterpeni ; terpeni ossidati

1. Introduzione

2. Materiali e metodi

La cannabis, che risale a migliaia di anni fa, è stata utilizzata nel trattamento di varie condizioni e ha mostrato un effetto pleiotropico [ 1 ]. Al giorno d’oggi, il potenziale terapeutico della Cannabis medica (MC) è riconosciuto e i pazienti hanno iniziato a considerarla un’alternativa valida [ 2 ]. Dal Canada all’Australia, più di trenta paesi (compresa la maggior parte degli stati degli Stati Uniti) hanno investito in programmi di cannabis medica e sono registrati oltre due milioni di utenti [ 3 ].La cannabis è prescritta per condizioni mediche specifiche (spesso “intolleranti” o “non responsivi” ai trattamenti di prima linea), inclusi dolore cronico e correlato al cancro, nausea e vomito prodotti dalla chemioterapia, cachessia correlata all’HIV, spasticità da sclerosi multipla, sindrome di Tourette , glaucoma ed epilessia pediatrica, così come stanno emergendo promesse per il trattamento di insonnia, depressione, ansia, autismo e malattia di Alzheimer [ 4 , 5 , 6 ].D’altronde i medici sono reticenti a prescrivere MC non per necessità di formazione ma anche per la mancanza di formulazioni standardizzate in termini di composti bioattivi, in particolare per i preparati galenici che dovrebbero invece permettere di sfruttare le potenzialità terapeutiche potenziale del fitocomplesso MC [ 7 ]. Le molecole MC più studiate ( Tabella 1 ) includono acido Δ9-tetra-idrocannabinoico (Δ9-THCA) (che viene decarbossilato a Δ9-THC dal calore e può ulteriormente degradarsi a cannabinolo), acido cannabidiolico (CBDA) e il suo metabolita decarbossilato CBD [ 8 , 9 , 10 ]. Il cannabinolo (CBN) è solitamente quantificabile e considerato un prodotto dell’ossidazione del THC [ 11]. La variabilità delle concentrazioni di cannabinoidi è stata riportata in preparazioni magistrali di MC estratte con diversi protocolli [ 12 17]. Inoltre, i fitocannabinoidi interagiscono con altre due importanti classi di composti, terpeni e flavonoidi [ 13 , 14 , 16 ]. Nella pianta di Cannabis sono presenti monoterpeni, diterpeni, triterpeni volatili (rispettivamente 10, 20 e 30 atomi di carbonio), così come i sesquiterpeni (15C) che potrebbero contribuire agli effetti antinfiammatori e antinocicettivi della Cannabis [ 15 ,], determinando così il cosiddetto effetto entourage (sinergico) [ 14 , 15]. Limonene, β-mircene e α-pinene rappresentano i principali componenti monoterpenici della Cannabis e il β-cariofillene è uno dei sesquiterpeni predominanti. L’A-pinene inibisce l’attività dell’acetilcolinesterasi nel cervello, riducendo così al minimo la disfunzione cognitiva causata dall’intossicazione da THC [ 18 ]. Si dice che il limonene aumenti i livelli di serotonina e dopamina, mimando così gli effetti ansiolitici, antinfiammatori e sedativi del CBD [ 19 ]. Il Β-cariofillene interagisce con i recettori dei cannabinoidi ed è responsabile delle proprietà antinfiammatorie della cannabis [ 20 ]. Sono stati riportati i suoi effetti antiossidanti, ansiolitici, analgesici e neuroprotettivi [ 21 ].Tabella 1. Classi principali di composti di Cannabis sativa (le immagini della struttura 2D sono disponibili all’indirizzo https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/#query=CID%20number (accesso il 20 gennaio 2022).

2.1. Sostanze chimiche e solventi

La concentrazione di queste molecole volatili è influenzata dalle condizioni di estrazione ad alta temperatura. Inoltre, l’ossidazione causata dalla luce UV o dal calore durante lo stoccaggio o la trasformazione può determinare la formazione di prodotti contenenti ossigeno come terpenoidi e chetoni [ 22 , 23 ]. Infatti, la fotoossidazione secondaria dei terpeni può determinare la generazione di idroperossidi allilici instabili la cui riduzione e successiva ossidazione può portare alla formazione di alcoli e quindi di aldeidi o chetoni [ 24 ]. Questi composti sono studiati per la loro potenziale tossicità, inerente alla promozione dello stress ossidativo [ 25 , 26 ].Una preparazione standardizzata del campione è quindi fondamentale per estrarre i cannabinoidi, preservare i terpeni volatili e ottenere il giusto equilibrio tra la decarbossilazione richiesta (cioè il preriscaldamento di Cannabis flos aumenta la concentrazione di cannabinoidi attivi) e la degradazione indesiderata del profilo volatile [ 27]. È necessario un prodotto finale ottimizzato e omogeneo per garantire la continuità terapeutica dei pazienti e anche per ridurre i problemi di sicurezza legati alla dose eccessiva o insufficiente di cannabis. In effetti, la cannabis medica è ben tollerata ma il rischio di effetti avversi segnalati (p. es., confusione, vertigini, sonnolenza, allucinazioni, euforia, nausea, vomito e diarrea) può aumentare nel rapido aumento del dosaggio e nel sottogruppo popolazione con farmacocinetica alterata come gli anziani, nonché per l’uso di preparazioni inadeguate di Cannabis medica [ 28 ].Per la Cannabis somministrata per via orale, gli estratti in diversi mezzi oleosi hanno mostrato una grande facilità nel modulare la dose e una buona biodisponibilità del prodotto [ 11 ]. In particolare, l’olio di trigliceridi a catena media (MCT) è attualmente considerato più adatto per estrarre un prodotto stabile con una maggiore concentrazione di composti bioattivi rispetto all’olio d’oliva, spesso impiegato come solvente [ 29 ]. Sono stati impostati diversi metodi di estrazione, inclusa una fase di decarbossilazione per aumentare la trasformazione di Δ9-THCA in Δ9-THC [ 30 , 31 , 32 ]. Inoltre, sono state applicate diverse temperature e tempi per evitare l’evaporazione e/o la degradazione dei terpeni.In questo contesto, proponiamo un nuovo metodo standardizzato e ottimizzato per ottenere un estratto di olio MCT di Cannabis flos con un alto contenuto di composti bioattivi come Δ9-THC e terpeni e il più basso tasso di prodotti degradati/ossidati. Il protocollo è stato confrontato con altre due procedure riportate mediante HPLC-ESI-MS/MS (analisi dei cannabinoidi) e tecniche sia HS-SPME-GC-MS che GC-FID (analisi dei terpeni). Questo sforzo può superare la sfida di avere un metodo consigliabile per produrre un olio di cannabis medicinale di alto valore.

Come solvente di estrazione è stato utilizzato olio di trigliceridi a catena media (MCT) (Labrafac Lipophile WL 1349; Lotto: W2105378). Gli standard analitici ( Tabella S1 ) sono stati acquistati da Sigma–Aldrich SpA (Milano, Italia): THC Cannabinoids Mixture-3 solution (standard multicomponente di soluzione certificata di (-)-Δ9-THC (CAS 1972-08-3), cannabinolo (CBN, CAS 521-35-7) e cannabidiolo (CBD, CAS 13956-29-1) 1,0 mg/mL in metanolo), THCA (CAS 23978-85-0) e CBDA (CAS 1244-58-2) 1 mg/mL in acetonitrile, standard interni (IS) Proadifen-SKF 525A (CAS 62-68-0) e tert-Butanolo (CAS 75-65-0), Cannabis Terpene Mix-A (CRM40755) e Mix-B (CRM40937), β-cariofillene (CAS 87-44-5), Limonene (CAS 138-86-3) e α -Soluzioni di Pinene (CAS 80-56-8) (2,0 mg/mL in metanolo). I solventi sono stati forniti da VWR™ International, LLC, inclusi metanolo, 2-propanolo, acetonitrile e acido formico.

2.2. Materiale vegetale ed estrazione di oli di cannabis

Inoltre, per questo studio è stato utilizzato 1 lotto (n 20i07EY20j07) di Cannabis flos Bedrocan ^® medica (THC 22% CBD < 1%) di Bedrocan International (Veendam, Paesi Bassi). Il materiale vegetale è stato conservato a temperatura ambiente o -20 ° C fino al momento dell’uso. Un totale di 2 diverse procedure di estrazione sono state eseguite in base a precedenti studi pubblicati [ 30 , 32 ] per ottenere olio di cannabis medico 1 (MCO-1) e MCO-2 (rispettivamente metodi SIFAP e Calvi). Inoltre, 1 nuovo metodo ottimizzato (metodo CERFIT) è stato applicato specificamente al presente studio per ottenere MCO-3. In breve, 5 g di Cannabis flos sono stati decarbossilati in un estrattore a microonde completamente automatizzato (Ethos X—Advanced Microwave Extraction System, Milestone, FKV SRL, Italia;https://www.milestonesrl.com/industries/cannabis-and-terpenes (accesso il 20 gennaio 2022)) fissati a 1500 Watt per raggiungere e mantenere una T = 100 °C. La decarbossilazione ciclica (tempo totale 8 h) è stata eseguita “caldo e freddo” nella modalità seguente per cinque volte ( Tabella 2 ).Tabella 2. Decarbossilazione ciclica applicata nel metodo CERFIT.

2.3. Preparazione del campione per l’analisi dei cannabinoidi

Un pallone ermeticamente chiuso è stato mantenuto a -25 ° C per 60 minuti, quindi il solvente di estrazione è stato aggiunto a Cannabis flos: l’olio MCT (50 ml) è stato utilizzato per tutte le preparazioni per ridurre al minimo gli effetti matrice. L’estrazione è stata effettuata mediante turbo emulsione della soluzione (Cannabis flos in olio MCT) per 5 min e sonicazione (200 W/30 kHz) con sonda inserita nel pallone d’olio per 8 min. Durante il tempo di sonicazione, il sistema è stato tenuto in un bagno d’acqua refrigerato e la temperatura è stata controllata con un termometro nel bagno d’acqua e uno nel pallone. Per ogni metodo sono stati preparati 10 campioni partendo da 5 g di cannabis flos in 50 ml di olio MCT. Tutti i campioni di olio finali (50 mL) sono stati protetti dalla luce in bottiglie di vetro ambrato e quindi conservati a 4 °C.

2.4. Analisi HPLC-MS/MS dei cannabinoidi

I campioni MCO per l’analisi della spettrometria di massa tandem (MS/MS) con cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) sono stati preparati sciogliendo 10 mg di olio di cannabis in 1,0 mL di 2-propanolo. Una misura di 50 µL di ciascun campione è stata quindi aggiunta a 950 µL di acetonitrile e 100 ng di IS; Sono stati iniettati 2 µl. Un’analisi è stata eseguita in duplice copia.

Tabella 4. Condizioni strumentali per l’analisi HPLC-MS-MS.

Le analisi sono state valutate utilizzando un HPLC-MS-MS TSQ Fortis II (Thermo Fisher Scientific, San Jose, CA) dotato di una pompa quaternaria Surveyor MS con degasatore, campionatore automatico Surveyor AS e forno con valvola Rheodyne con un ciclo da 20 µL. Per la separazione cromatografica, abbiamo utilizzato una colonna HPLC con fase inversa Agilent Poroshell 120 C-18 2,7 µm–4,6 × 150 mm. La fase mobile utilizzata per i gradienti ( Tabella 3 ) era composta da acqua allo 0,1% di acido formico (Solvente A) e metanolo (Solvente B). Le condizioni strumentali per TSQ Fortis II sono riassunte nella Tabella 4 . È stata applicata la modalità di acquisizione del monitoraggio della reazione multipla (MRM) e le transizioni selezionate sono riportate nella Tabella 5 .Tabella 3. Gradienti del solvente per l’analisi HPLC-MS-MS.

Tabella 5. Transizioni MRM dei cannabinoidi bersaglio.

2.5. Preparazione del campione per l’analisi dei terpeni

L’estrazione dei terpeni totali dagli oli di cannabis è stata effettuata mediante microestrazione in fase solida in spazio di testa (HS-SPME). È stata impiegata una fibra CAR/PDMS/DVB. Prima dell’analisi, 500 mg di ciascun campione di olio sono stati posti in una fiala con spazio di testa insieme a 200 µl di IS ( terz -Butanolo 0,02%) e incubati a 80 °C per 1 ora. Quindi, 500 µL di gas sono stati analizzati mediante gascromatografia (GC) con uno spettrometro di massa (MS). Dopo ogni analisi, la fibra è stata ricondizionata per 5 minuti a 250 °C per prevenire qualsiasi contaminazione [ 30 ].

2.6. Analisi GC/MS dei terpeni

Le analisi sono state eseguite con un Trace GC Ultra (Thermo-Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) dotato di una colonna STABILWAX-MS (30 m × 0,25 mm id 0,25 µm di spessore del film; Restek, Bellefonte, PA, USA), un quadrupolo spettrometro di massa Trace DSQII (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA). La temperatura dell’iniettore, nella modalità split selezionata 10:1, era di 250 °C e quelle del rivelatore e della linea di trasferimento erano rispettivamente di 250 e 210 °C. Il programma di temperatura del forno era: 35°C 5 min, da 35 a 60 °C a 4 °C/min, poi da 60 a 160 °C a 6 °C/min, da 160 a 200 °C a 20 °C/ min e infine 200 °C a 20 min [ 32 ]. La quantificazione dei terpeni identificati è stata eseguita con una curva di calibrazione (y = bx + a) di ciascuno standard relativo (cioè, β-cariofillene, limonene e α-pinene). Le curve di calibrazione sono state riportate inFigure S1–S3 . Gli spettri MS dei picchi di eluizione sono stati confrontati con quelli delle miscele standard di terpeni per caratterizzare e dividere i terpeni in base alla loro struttura isoprenica. La quantificazione dei mono/di/triterpeni totali, dei sesquiterpeni totali e dei terpeni ossidati totali è stata calcolata riassumendo una singola quantità di ciascun terpene della stessa classe chimica.

2.7. Analisi statistica

Le concentrazioni di cannabinoidi e terpeni negli MCO analizzati sono state espresse sia come valore medio e relativa deviazione standard (DS), sia come valore mediano e intervallo (min-max). Le differenze nelle concentrazioni medie e mediane tra i diversi MCO sono state testate utilizzando l’ANOVA unidirezionale seguita dall’analisi post-hoc di Tukey-Kramer e il test di Kruskal-Wallis seguito rispettivamente dal test di confronto multiplo di Dunn. L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software STATA versione 17. La significatività statistica è stata considerata per p -value < 0,05.

3. Risultati

3.1. Metodi di estrazione per oli di cannabis terapeutici

In questo lavoro sono stati applicati due metodi precedentemente descritti in letteratura per la preparazione di MCO [ 30 , 32 ]. Includevano una fase di decarbossilazione a 115 ° C per 40 minuti e 130 ° C per 30 minuti, rispettivamente. Nel primo metodo, il materiale vegetale è stato estratto mediante macerazione a 100 °C per 40 minuti [ 32 ] mentre nel secondo metodo l’estrazione è stata effettuata per 30 minuti mediante sonicazione a temperatura controllata [ 30 ]. È stato dimostrato che l’olio MCT estrae e conserva una concentrazione significativa di terpeni rispetto all’olio d’oliva [ 29]. Per questo motivo, abbiamo scelto di utilizzare l’olio MCT per tutti i metodi al fine di ridurre al minimo le differenze dovute agli effetti matrice. Oltre a questi metodi, in questo lavoro è stata sviluppata una nuova procedura di estrazione (metodo CERFIT). Il materiale vegetale è stato conservato a -20 ° C fino al momento dell’uso; pertanto è stato messo in forno ventilato a 25°C per 60 minuti prima della pesatura. La decarbossilazione del materiale vegetale è stata effettuata a temperatura inferiore (100 °C) per un tempo più breve (10 min) in CERFIT rispetto agli altri due metodi: questo passaggio è stato ripetuto cinque volte in modo da alternare riscaldamento e raffreddamento per preservare il fitocomplesso. Inoltre, il pallone chiuso è stato mantenuto sotto vuoto controllato per evitare la perdita di composti volatili. Al termine del processo ciclico, il pallone è stato mantenuto a -25°C per 60 minuti recuperando i componenti volatili dell’olio essenziale. Quindi, l’estrazione è stata eseguita ponendo un sonicatore a sonda nel pallone (olio MCT più Cannabis flos) e il sistema in un bagnomaria refrigerato. Infine, il prodotto è stato filtrato e confezionato.Sono stati estratti dieci campioni di cannabis con ciascun metodo e le condizioni sperimentali sono confrontate nella Tabella 6 . Partendo da 5 g di flos di cannabis in 50 ml di olio MCT, è stato ottenuto un prodotto finale di 50 ml di olio di cannabis terapeutica. Il profilo dei cannabinoidi e dei terpeni è stato analizzato per tutti i campioni (10 campioni per ciascun metodo).Tabella 6. Confronto dettagliato dei tre metodi utilizzati per la preparazione dell’olio di cannabis in questo studio.

3.2. Cannabinoidi negli oli di cannabis medica

Le concentrazioni di CBD, CBDA, CBN, Δ9-THC e Δ9-THCA nelle preparazioni MCO sono riportate nella Tabella 7 . Un cromatogramma HPLC-ESI-MS/MS rappresentativo di un punto di calibrazione standard per gli analiti è mostrato in Figura 1 . Le quantità di cannabinoidi sono state trovate in linea con i dati disponibili in letteratura per le preparazioni di Bedrocan® ^flos [ 30 , 31 , 32 ].

Figura 1. Cromatogramma di massa HPLC-MS/MS di un punto di calibrazione standard per analiti coinvolti nello studio.Tabella 7. Cannabinoidi (mg/mL) negli estratti di MC. Dati di dieci esperimenti separati, ciascuno eseguito in triplicato. Sono state applicate analisi post-hoc di Tukey-Kramer (per ANOVA a una via) o Dunn (per il test di Kruskal-Wallis). Le differenze sono state considerate significative quando p < 0,05 e sono indicate con diverse lettere in apice: in ogni riga, i valori con una lettera diversa (a, b o c per i valori medi; d, e o f per i valori mediani) sono significativamente diversi ( p < 0,05).

La concentrazione neutra psicoattiva di Δ9-THC era alta e costante in tutti gli oli di cannabis (18,0–23,9 mg/mL), al contrario il suo precursore acido Δ9-THCA era sottorappresentato (0,0–0,7 mg/mL) a seconda della presenza di una fase di decarbossilazione ( Figura 2a ). Il confronto dei 3 MCO ha mostrato che MCO-1 aveva il 9% di Δ9-THC in più e il 18% in meno di Δ9-THCA rispetto a MCO-2 e MCO-3.

Figura 2. Distribuzione delle concentrazioni di Δ9-THC, Δ9-THCA (riquadro ( a )), CBD e CBDA (riquadro ( b )) in preparazioni mediche di olio di cannabis estratte con tre diversi metodi.Il metodo SIFAP non è riuscito a estrarre il CBD e il suo precursore acido CBDA che sono stati leggermente recuperati con le altre due procedure (0–0,13 e 0–0,20 mg/mL, rispettivamente). Il CBN, analizzato per monitorare l’eventuale degradazione/ossidazione degli oli di cannabis [ 33 ], era presente in quantità basse (<0,20 mg/mL) in MCO1 e 2, mentre MCO3 mostrava un intervallo più alto (0,02–1,06 mg/mL) rispetto agli altri ( Figura 2b).Nel complesso, i tre metodi si sono comportati in modo simile in termini di resa quantitativa finale dei cannabinoidi estratti.

3.3. Terpeni negli oli di cannabis medica

L’analisi dei composti volatili nei tre MCO è stata eseguita mediante HS-SPME accoppiato sia con GC-FID che con GC-MS ( Figura 3 ). I volatili identificati sono stati trovati in linea con i dati disponibili in letteratura per i preparati per flos Bedrocan ^® [ 11 , 30 ]. I dati quantitativi degli MCO sono riportati nella Tabella 8 .

Figura 3. Cromatogrammi GC/MS rappresentativi degli estratti ottenuti dalla cannabis medica.Tabella 8. Terpeni negli estratti di MCO. Dati di dieci esperimenti separati, ciascuno eseguito in triplicato. Sono state applicate analisi post-hoc di Tukey-Kramer (per ANOVA a una via) o Dunn (per il test di Kruskal-Wallis). Le differenze sono state considerate significative quando p < 0,05 e sono indicate con diverse lettere in apice: in ogni riga, i valori con una lettera diversa (a, b o c per i valori medi; d, e o f per i valori mediani) sono significativamente diversi ( p < 0,05).

I mono-di-tri-terpeni erano altamente rappresentati in tutti i campioni, rappresentando l’84-94% della concentrazione totale di terpeni identificata di ciascun MCO con un aumento di due o tre volte rispettivamente per MCO-2 e MCO-3, rispetto a MCO -1 ( Figura 4 ). Le molecole quantificate appartenenti a questa classe chimica erano α-pinene e limonene che mostravano una tendenza all’aumento significativa da MCO-1 a MCO-3 ( valore p < 0,001; Figura 5 ).

Figura 4. Confronto delle concentrazioni delle classi di terpeni (μg/mL) ottenute con i tre diversi metodi di estrazione.

Figura 5. Distribuzione delle concentrazioni di β-cariofillene, limonene e α-pinene nei preparati a base di olio di cannabis medica estratti con tre diversi metodi.I sesquiterpeni erano circa il 6% del totale dei terpeni identificati in ciascun MCO; MCO-3 aveva una concentrazione significativamente aumentata rispetto a MCO-2 e MCO-1 ( valore p <0,001; Figura 4 ). È interessante notare che MCO-3 e MCO-2 erano caratterizzati da una minore presenza di β-cariofillene (rispettivamente 13 e 22%) rispetto a MCO-1 (48%). Questi dati potrebbero indicare un diverso profilo qualitativo volatile per i campioni MCO-3, ottenuti con il metodo CERFIT ( Figura 5 ).I terpeni ossidati, solitamente prodotti dalla fotoossidazione dei terpeni primari [ 30 ], sono stati rilevati solo in MCO-1 (9,6% dei terpeni totali; Figura 4 ).Nel complesso, i tre metodi hanno mostrato prestazioni simili in termini di resa quantitativa finale dei cannabinoidi estratti. I campioni estratti con i metodi CERFIT hanno invece mostrato un profilo distintivo altamente ricco di terpeni e privo di prodotti volatili ossidati.

4. Discussione

Qui, abbiamo confrontato le concentrazioni di cannabinoidi e terpeni di tre MCO ottenuti con tre diverse procedure di estrazione al fine di migliorare il profilo terapeutico del prodotto finale. In particolare, sono state eseguite analisi quantitative dei terpeni mentre diversi studi sugli MCO non hanno indagato sui composti volatili della cannabis o eseguito approcci qualitativi o semiquantitativi [ 31 , 32 ].Per lo sviluppo del protocollo di estrazione, questo lavoro si è concentrato principalmente sulle temperature e sui tempi della decarbossilazione e sui passaggi successivi. È noto che la decarbossilazione (preriscaldamento) del materiale vegetale di partenza è necessaria per la conversione da forma acida a forma di cannabinoide neutra [ 34 ]. Infatti, le concentrazioni di cannabinoidi nei 3 MCO (tutti i metodi compreso il preriscaldamento di almeno 100 °C) sono risultate coerenti con i risultati precedenti e in linea con le quantità dichiarate dal produttore (Bedrocan) nel materiale vegetale [ 30 , 31 , 32 ]. D’altra parte, l’applicazione di temperature elevate per lungo tempo ha aumentato il rischio di evaporazione/degradazione termica volatile [ 35]. Pertanto, la nostra ipotesi di lavoro era che un metodo di estrazione migliorato dovesse includere una fase di decarbossilazione con conseguente elevata concentrazione di cannabinoidi e perdita minima di terpeni. L’innovativo metodo CERFIT ha decarbossilato Cannabis flos a temperatura moderata (max 100 °C) in un sistema sottovuoto assistito da microonde (per preservare la preparazione dall’umidità esterna): il microonde è risultato più efficace dell’estrazione convenzionale [ 35]. Inoltre, abbiamo introdotto una variazione ciclica della temperatura in questa fase di preriscaldamento in modo da avere una rotazione tra riscaldamento (max 100 °C per 10 min) e raffreddamento (100–25 °C per 25 min) e riposo (25 °C per 55 min) ridurre lo stress termico del fitocomplesso. Oltre alle procedure SIFAP e CALVI, è stato aggiunto un passaggio finale a -25 ° C per 60 minuti per condensare i componenti evaporati senza perdita di composti volatili. Inoltre, è importante sottolineare che il nostro metodo ha permesso il pieno recupero dell’MCO finale (ovvero, partendo da 5 g di Cannabis flos in 50 ml, abbiamo ottenuto 50 ml di olio di cannabis terapeutica): questa resa (100%) è data da un controllo costante del sistema di filtrazione applicato prima del confezionamento. Infine, potremmo sostenere la buona scalabilità del metodo CERFIT. Infatti,Una significativa tendenza all’aumento ha determinato le concentrazioni totali di terpeni degli MCO estratti con i tre metodi (SIFAP < CALVI < CERFIT). Questo risultato potrebbe essere determinato anche dalla tecnica di estrazione utilizzata: l’estrazione assistita da ultrasuoni è stata segnalata più efficace delle procedure convenzionali [ 36]. Inoltre, nel metodo CALVI, gli ultrasuoni sono stati applicati per 30 min a bagnomaria contenente il pallone con infiorescenze in olio MCT. Il metodo CERFIT utilizzava un sonicatore a sonda all’interno del pallone mantenuto in un bagno d’acqua refrigerato. Al termine dell’estrazione i bagni d’acqua avevano una T di circa 45 °C e 21 °C, rispettivamente, e questa differenza potrebbe spiegare la maggiore efficacia del metodo CERFIT poiché temperature più basse sono state riportate per aumentare la cavitazione e di conseguenza la resa del composti bioattivi estratti [ 37 ].È interessante notare che i sesquiterpeni totali sono aumentati nell’MCO estratti con il metodo CERFIT mentre la concentrazione di β-cariofillene è diminuita. Pertanto, il metodo di estrazione sembrava influenzare la composizione qualitativa del prodotto petrolifero finale nonché il profilo quantitativo dei composti volatili.Sorprendentemente, la composizione finale di MCO-2 e MCO-3 è stata ulteriormente variata. In particolare erano privi di terpeni ossidati, quindi privi di prodotti di ossidazione termica secondaria come aldeidi e chetoni [ 30 , 38 ]. La formazione di questi composti potrebbe influenzare significativamente la qualità di un prodotto essendo un marker di invecchiamento [ 38 ]. Ad esempio, la presenza di terpeni ossidati negli oli essenziali è stata associata a variazioni di colore, odore sgradevole, gusto sgradevole e alterazioni della consistenza [ 39 ]. L’ossidazione dei terpeni può produrre sensibilizzanti cutanei che causano reazioni allergiche pericolose in individui sensibili [ 40 , 41 , 42]. Generalmente, la tossicità dei terpeni e dei loro derivati ​​ossidati è attribuita al loro potere pro-ossidante che origina la formazione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) attraverso la perossidazione lipidica [ 43 ]. Ad esempio, la tossicità acuta del limonene è segnalata associata al suo prodotto ossidato che è il limonene idroperossido [ 44 ]. Pertanto, l’assenza di componenti ossidati negli MCO è un requisito importante sia per il controllo di qualità del prodotto che per la sicurezza dei pazienti [ 38 ].Infine, i risultati delle prove sul ruolo sinergico dei terpeni della Cannabis e dei cannabinoidi fino ad oggi erano contrastanti [ 45 ], ma nessuno studio ha studiato gli effetti di preparazioni di Cannabis medica ricche di terpeni idrocarburici senza composti ossidanti, costituenti potenzialmente dannosi [ 46 , 47 ].A nostro avviso, il nuovo estratto è molto promettente sia per l’attività biologica dei singoli terpeni che per il relativo effetto entourage [ 48 ]. Infatti, i più importanti terpeni della Cannabis (limonene, pinene, mircene, β-cariofillene e linalolo) sono stati segnalati come individualmente responsabili degli effetti antinfiammatori, analgesici, antinocicettivi, ansiolitici e multi-bersaglio [ 49 ]. Contemporaneamente, è stato mostrato l’effetto sinergico tra fitocannabinoidi [ 49 , 50 ] e terpeni e fitocannabinoidi [ 51 ]. In questo contesto, un’attività differenziale del recettore dei cannabinoidi [ 52 ] e l’inibizione della p-glicoproteina [ 52 , 53] dai terpeni sono stati studiati. Inoltre, diversi studi hanno dimostrato l’attività di potenziatore terpenico sull’assorbimento di sostanze attive [ 54 , 55 ], come nel caso di analgesici e antinfiammatori [ 56 , 57 ]. Ad esempio, il limonene e il bisabololo sono stati studiati come potenziatori dell’assorbimento percutaneo del sumatriptan [ 58 ] e l’assorbimento cutaneo del naprossene è stato aumentato dal linalolo [ 59 ]. Inoltre, una preparazione di cannabis contenente i terpeni più importanti potrebbe esercitare una sinergia multi-target [ 60]. In effetti, ogni componente del fitocomplesso potrebbe avere una bassa potenza terapeutica ma la loro simultanea azione farmacologica si è spesso dimostrata altamente efficace con una tossicità significativamente bassa [ 61 ]. Pertanto, è importante ottenere preparati concentrati di olio di cannabis e mantenere il loro contenuto di terpeni.

5. Conclusioni

Il protocollo di estrazione CERFIT è stato in grado di ottenere una composizione MCO aumentata nelle concentrazioni totali di mono-di-triterpeni e sesquiterpeni e senza terpeni ossidati. Questo prodotto ricco di composti bioattivi ha il pieno potenziale per mostrare importanti miglioramenti terapeutici nelle indagini cliniche future essenziali.

Materiali supplementari

I seguenti sono disponibili online all’indirizzo https://www.mdpi.com/article/10.3390/pharmaceutics14020298/s1 , Figura S1: Curva di calibrazione per la quantificazione del β-cariofillene, Figura S2: Curva di calibrazione per la quantificazione del limonene, Figura S3: Calibrazione curva per la quantificazione dell’α-pinene, Tabella S1: Standard analitici utilizzati per l’analisi quantitativa dei terpeni.

Contributi dell’autore

I dati presentati in questo studio sono disponibili nell’articolo e nel materiale supplementare e dall’autore corrispondente su ragionevole richiesta.

Ringraziamenti

Carlo Monaco, Santa Sarta, Giorgio Gatti; Elisa Civati, Andrea Spampatti, Napoleone Spampatti per il supporto amministrativo e tecnico.

Conflitto di interessi

Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio; nella raccolta, analisi o interpretazione di dati; nella stesura del manoscritto, o nella decisione di pubblicare i risultati.

Riferimenti

Concettualizzazione, VM, LC, TP e FF; Data curation, VM ed ERG; Analisi formale, VM e DDC; Indagine, VM e TP; Metodologia, TP, CC e DDC; Risorse, RS e FF; Supervisione, LC e FF; Validazione, TP, ERG, CP, FS, PM, DDC, RS e FF; Visualizzazione, VM, LC, CP, FS e PM; Scrittura: bozza originale, VM e TP Tutti gli autori hanno letto e accettato la versione pubblicata del manoscritto.

Finanziamento

Questa ricerca è stata finanziata dalla Regione Toscana (Italia), Programma di Medicina Complementari (Delibera n. 417/2021), borsa di studio 20MECO.

Dichiarazione del comitato di revisione istituzionale

Non applicabile.

Dichiarazione di consenso informato

Non applicabile.

Dichiarazione sulla disponibilità dei dati

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© 2022 degli autori. Licenziatario MDPI, Basilea, Svizzera. Questo articolo è un articolo ad accesso aperto distribuito secondo i termini e le condizioni della licenza Creative Commons Attribution (CC BY) ( https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ ).

Articolo e tabelle tradotte dal sito della rivista scientifica Pharmaceutics https://www.mdpi.com/1999-4923/14/2/298

“An Optimized Terpene Profile for a New Medical Cannabis Oil” Pharmaceutics 14, no. 2: 298. https://doi.org/10.3390/pharmaceutics14020298